Предисловие ..................................................... 8

Раздел 1. Основные приемы генной инженерии ...................... 9
Глава 1. Введение ............................................... 9
   Основные определения ......................................... 9
   Методы, применяемые в генной инженерии и биотехнологии ...... 10
   Основные события в истории молекулярной биотехнологии ....... 10
   Открытие рестрикции ......................................... 11
   Проблемы биологической безопасности, связанные с работой
   с рекомбинантной ДНК ........................................ 13
Глава 2. Ферменты, используемые в генной инженерии ............. 17
   Нуклеазы .................................................... 17
   Лигазы ...................................................... 27
   Полимеразы .................................................. 28
   Ферменты, модифицирующие ДНК и РНК .......................... 30
   Соединение фрагментов ДНК, разрезанных рестриктазами ........ 30
   Превращение тупых концов в липкие ........................... 31
Глава 3. Электрофорез и секвенирование ......................... 33
   Разделение фрагментов ДНК ................................... 33
   Использование электрофореза в агарозном геле ................ 36
   Пульс-электрофорез как метод разделения крупных фрагментов
   ДНК ......................................................... 37
   Капиллярный электрофорез .................................... 38
   Физическое картирование с помощью рестриктаз ................ 39
   Методы переноса молекул на мембраны ......................... 41
   Получение зондов для гибридизации ........................... 44
   Секвенирование ДНК .......................................... 46
   Роль секвенирования ......................................... 50
   Химический синтез олигонуклеотидов .......................... 51
Глава 4. Полимеразная цепная реакция ........................... 53
   Основные этапы ПЦР .......................................... 54
   ДНК-полимеразы и ПЦР ........................................ 56
   Дизайн праймеров для ПЦР .................................... 57
   Анализ ПЦР-продуктов ........................................ 60
   Клонирование продуктов ПЦР .................................. 61
   Варианты ПЦР ................................................ 64
   Использование ПЦР ........................................... 67
   Достоинства и недостатки ПЦР ................................ 69
Глава 5. Молекулярно-генетические маркеры и их практическое
   использование ............................................... 71
   ДНК-маркеры ................................................. 71
   История ДНК-типирования ..................................... 72
   Использование протяженных последовательностей в качестве
   генетических маркеров (ДНК-фингерпринтинг) .................. 73
   Использование ПЦР в ДНК-тестировании (STR-маркеры) .......... 79
   Использование однонуклеотидных замен (SNP-маркеры) .......... 84
   Использование коротких стандартных последовательностей ДНК
   для идентификации видов (ДНК-штрихкод, или ДНК-баркодинг) ... 84
   Репортерные гены ............................................ 85
Глава 6. Изменение и анализ последовательностей ДНК
   с помощью мутагенеза ........................................ 89
   Общая схема мутагенеза in vitro ............................. 89
   Мутагенез регуляторных областей ............................. 91
   Мутагенез кодирующих последовательностей .................... 94
   Замещение гена и добавление гена ............................ 99
   Направленный мутагенез с использованием системы Cre/IoxP ... 100
   «Редактирование» генома с помощью нуклеаз ZFN, TALEN
   и CRISPR/Cas9 .............................................. 102
   Применение антисмысловых (антисенс) олигонуклеотидов ....... 104
   Транспозоновый «мутагенез» ................................. 106
Глава 7. Способы введения чужеродной ДНК в клетки ............. 109
   Основные требования к вектору .............................. 109
   История создания векторов .................................. 112
   Некоторые векторы, используемые для клонирования генов ..... 114
   Разработка улучшенных бактериальных штаммов ................ 116
   Способы введения плазмидной ДНК в клетки ................... 117
Глава 8. Создание библиотек генов и их скрининг ............... 120
   Основные этапы клонирования ................................ 120
   Выбор источника ДНК для клонирования ....................... 121
   Создание библиотек на основе кДНК .......................... 122
   Клонирование геномной ДНК .................................. 126
   Скрининг библиотек генов ................................... 132
   Значение клонирования ...................................... 142
Глава 9. Получение рекомбинантных белков ...................... 144
   Рекомбинантные белки, определение .......................... 144
   Применение очищенных рекомбинантных белков ................. 145
   История получения первых рекомбинантных белков ............. 147
   Этапы получения определенного белка ........................ 148
   Основные способы получения белков в биотехнологии .......... 150

Раздел 2. Использование одноклеточных организмов и клеток
   насекомых в качестве продуцентов чужеродных белков ......... 155
Глава 10. Экспрессия генов в клетках прокариот ................ 155
   Оптимизация экспрессии чужеродных генов в клетках
   бактерий ................................................... 156
   Эффективная транскрипция чужеродного гена .................. 157
   Эффективная трансляция чужеродного гена .................... 160
   Посттрансляционные события ................................. 163
   Использование химерных белков .............................. 164
   Использование различных видов бактерий в качестве
   продуцентов чужеродных белков .............................. 166
Глава 11. Использование дрожжей в генной инженерии и
   биотехнологии .............................................. 168
   Достоинства и недостатки дрожжей в качестве продуцентов
   чужеродных белков .......................................... 168
   Синтез чужеродных белков в Pichia pastoris ................. 169
   Системы экспрессии Saccharomyces cerevisiae ................ 172
   Дрожжи S. cerevisiae в биотехнологии ....................... 174
   Дрожжевая двугибридная система (two-hybrid system) ......... 175
Глава 12. Бакуловирусы как одни из наиболее перспективных
   объектов для синтеза гетерологичных белков ................. 182
   Жизненный цикл бакуловирусов ............................... 183
   Бакуловирусы как природные инсектициды ..................... 186
   Культуры клеток насекомых .................................. 188
   Бакуловирусы в качестве векторов для переноса чужеродных
   генов ...................................................... 188
   Усовершенствование «инсектицидных» свойств бакуловирусов ... 191
   Достоинства и недостатки бакуловирусной системы
   экспрессии ................................................. 193

Раздел 3. Млекопитающие как объект генной инженерии
   и биотехнологии ............................................ 195
Глава 13. Экспрессия трансгенов в клетках млекопитающих ....... 195
   Способы введения чужеродной ДНК в клетки млекопитающих ..... 196
   Временная и стабильная экспрессия трансгенов ............... 197
   Использование временной экспрессии ......................... 197
   Селективные маркеры ........................................ 199
   Получение клеток с направленной интеграцией трансгена ...... 203
   Способы доставки генов в клетки млекопитающих .............. 204
   Основные векторные системы клеток животных, основанные на
   использовании вирусов ...................................... 206
   Подходы, позволяющие увеличить экспрессию трансгена ........ 217
   Ограничения современных методов переноса генов в клетки
   млекопитающих .............................................. 220
Глава 14. Трансгенные животные и их использование ............. 221
   Общая схема получения трансгенных животных ................. 221
   Основные методы получения трансгенных животных ............. 223
   Трансгенные животные. Мыши ................................. 228
   Использование трансгенных мышей ............................ 233
   Трансгенные коровы, козы, овцы ............................. 235
   Использование трансгенных свиней и ксенотрансплантация ..... 237
   Получение трансгенных рыб .................................. 242
   Трансгенные птицы .......................................... 245
   Достоинства и недостатки трансгенных животных .............. 246
Глава 15. Генная терапия ...................................... 247
   Понятие, генной или генетической, терапии .................. 247
   Стратегии генной терапии ................................... 250
   Этапы генной терапии ....................................... 250
   Системы переноса трансгенов ................................ 253
   Основные фазы клинических испытаний ........................ 267
   Успехи генотерапии ......................................... 268
   Генная терапия в будущем ................................... 269
Глава 16. Клонирование животных ............................... 270
   Основные стадии клонирования ............................... 272
   Клонирование овцы Долли .................................... 274
   Дефекты клонов ............................................. 276
   Использование клонирования и его ограничения ............... 276

Раздел 4. Методы геномики и транскриптомики ................... 284
Глава 17. Геномные и постгеномные методы ...................... 284
   Секвенирование геномов ..................................... 284
   Геномные проекты ........................................... 287
   Геномика и метагеномика .................................... 291
   Массовый анализ экспрессии генов ........................... 292
   Заключение ................................................. 303
   Рекомендуемая литература ................................... 306
   Общая литература ........................................... 306
   Дополнительная литература и полезные сайты Интернета ....... 306
   Именной указатель .......................................... 315
   Предметный указатель ....................................... 316
   Указатель латинских названий ............................... 323
   Список использованной литературы ........................... 324